La chromatographie

Méthodologie

Fig. Chromatographie d'élution sur colonne

Une colonne est remplie avec une phase stationnaire ou fixe.

●Une phase mobile, ou solvant organique (ou mélange de solvants) ou éluant, est introduite au sommet de la colonne et entraîne les constituants (ou solutés) du mélange.

●Le solvant entraîne les molécules de solutés. Il existe une série de transferts entre les 2 phases.

●Les constituants du mélange migrent avec des vitesses différentes. Ils sont élués (déplacés) et recueillis séparément, en solution dans la phase mobile, dans un détecteur de concentration.

●Un chromatogramme présente des pics en fonction du temps.

3. Grandeurs caractéristiques en analyse chromatographique sur colonne

3.1. Vitesses de déplacement des solutés

Le pouvoir séparateur d’une colonne est fonction des vitesses relatives d’élution. Ces vitesses sont donc fonction du coefficient de distribution des solutés entre les 2 phases :

Coefficient de distribution :

Où :

 C_S est la concentration du soluté en phase stationnaire (mol/l).

 C_M la concentration du soluté en phase mobile (mol/l).

Temps de rétention t_R : temps qui s’écoule entre l’injection de l’échantillon et l’apparition d’un pic de soluté sur le détecteur d’une colonne chromatographique.

Temps mort t_M : temps nécessaire pour qu’une espèce non retenue par la phase stationnaire traverse la colonne.

Temps de rétention du soluté

Le pic de gauche correspond au soluté qui n'est pas retenu par la phase stationnaire et qui atteint le détecteur à la même vitesse que celle de l'éluant.

Son temps de rétention t_M est le temps nécessaire pour qu'une molécule de la phase mobile traverse la colonne.

t_M=temps mort = t₀ = temps nécessaire pour que le pic d'un constituant non retenu par la PS apparaisse (retention time of an unretained peak or solvent front).

t_R = temps de rétention d'un constituant retenu par la PS (retained peak) = temps écoulé entre l'injection et le moment où le constituant sort de la colonne.

3.2. Vitesse linéaire moyenne de déplacement du soluté :

où L est la longueur de la colonne.

3.3. Vitesse linéaire moyenne de la phase mobile :

Relation entre vitesse de déplacement et coefficient de distribution :

Où :

 V_S et V_M sont les volumes de solutés respectivement dans la phase stationnaire et mobile (aussi appelé volume mort), or ces volumes sont proportionnels aux volumes des 2 phases respectivement, ils peuvent donc être estimés si on connaît la structure géométrique de la colonne.

Temps réduit t'_R :

Volume réduit V'_R :

Débit D :

Certains paramètres qui affectent les vitesses relatives des analytes peuvent être modifiés :

• Vitesse linéaire de la phase mobile 
• Coefficient de diffusion dans la phase  mobile
• Coefficient de diffusion dans la phase stationnaire
• Facteur de capacité k’
• Diamètre des particules support
• Épaisseur de la couche liquide sur la phase stationnaire

3.4. Facteur de capacité

Facteur de capacité k' : paramètre expérimental important permettant de décrire la vitesse de progression des solutés dans les colonnes. C’est le rapport des quantités d’un analyte présentes à l’équilibre dans les 2 volumes de phase stationnaire et mobile adjacentes. Le facteur de capacité dépend de la température (CPG), du remplissage de la colonne (CPG), de la composition de la phase mobile et stationnaire (HPLC)...

• k'<1 : élution trop rapide
• 1<k'<5 : élution optimale
• 5<k' : élution trop lente

3.5. Facteur de sélectivité α : rapport du coefficient de distribution du soluté qui est retenu le plus sur le coefficient de distribution du soluté qui est retenu le moins. Le facteur de sélectivité de deux analytes permet d’estimer à quel point la colonne peut les séparer. Il est donc utilisé pour calculer le pouvoir séparateur d’une colonne. α >1 toujours.